酶聯(lián)免疫試劑盒(ELISA)是生物醫(yī)學(xué)研究中檢測(cè)抗原或抗體的核心工具，廣泛應(yīng)用于疾病診斷、食品安全檢測(cè)及科研實(shí)驗(yàn)。其結(jié)果的可靠性依賴于嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，從樣本處理到較終OD值(光密度值)解讀，每一步都需精準(zhǔn)控制。以下為全流程操作指南：
一、樣本處理：
樣本類(lèi)型多樣(如血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清)，處理不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物降解或干擾檢測(cè)。關(guān)鍵步驟包括：
•血清/血漿分離：靜脈采血后靜置30分鐘(促凝管)或離心(2000-3000rpm，10-15分鐘，4℃)，分離血清/血漿后立即分裝(避免反復(fù)凍融)，-20℃保存(長(zhǎng)期保存需-80℃)，防止蛋白變性。
•組織/細(xì)胞樣本：勻漿后離心(12000rpm，10分鐘，4℃)取上清，用PBS(pH 7.4)稀釋至合適濃度(參考試劑盒說(shuō)明書(shū))，避免顆粒雜質(zhì)堵塞微孔板。
•避免干擾物：樣本中若含疊氮鈉(防腐劑)、甘油(高濃度)或脂類(lèi)，需提前處理(如過(guò)濾或稀釋)，防止抑制酶活性或影響顯色。
二、加樣與孵育：
1.加樣：使用排槍或單道移液器(避免交叉污染)，將標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及樣本按順序加入微孔板(通常為96孔，每孔100μL)，加樣時(shí)槍頭垂直懸空(避免觸碰孔壁)，保證每孔體積一致(誤差≤2%)。
2.孵育：根據(jù)試劑盒要求，室溫(20-25℃)或37℃孵育(常見(jiàn)1-2小時(shí))。孵育期間需避光(防止光敏反應(yīng))，并將微孔板置于濕盒中(保持濕度>80%，避免孔內(nèi)液體蒸發(fā)導(dǎo)致濃度變化)。
三、洗滌：
洗滌是降低背景信號(hào)的關(guān)鍵步驟。用PBS-Tween 20(0.05%Tween 20的PBS緩沖液)作為洗滌液，通過(guò)洗板機(jī)(自動(dòng))或手動(dòng)(每孔300μL，重復(fù)3-5次)清洗微孔板，每次洗滌后需拍干(用干凈吸水紙輕壓孔底，避免殘留液體)。過(guò)度洗滌可能導(dǎo)致抗體脫落，洗滌不足則會(huì)增加非特異性吸附(背景值升高)。
四、顯色與終止：信號(hào)生成的精準(zhǔn)調(diào)控
1.加酶標(biāo)二抗/底物：孵育后加入酶標(biāo)記的二抗(如HRP標(biāo)記，對(duì)應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶)或底物溶液(如TMB，四甲基聯(lián)苯胺)，37℃避光孵育15-30分鐘(HRP-TMB體系顯色至藍(lán)色，AP-PNPP體系顯色至黃色)。
2.終止反應(yīng)：加入終止液(如1M硫酸或2M鹽酸，針對(duì)TMB體系)，立即終止酶促反應(yīng)(溶液由藍(lán)色變黃色，30分鐘內(nèi)完成讀數(shù))。
五、OD值解讀：
使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)(參考波長(zhǎng)630nm校正背景)讀取各孔OD值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品濃度與OD值線性回歸方程)計(jì)算樣本中目標(biāo)物的濃度。關(guān)鍵注意事項(xiàng)：
•空白對(duì)照校正：用不含抗原/抗體的孔(僅緩沖液)調(diào)零，消除背景干擾；
•質(zhì)控驗(yàn)證：陽(yáng)性對(duì)照OD值應(yīng)在試劑盒規(guī)定范圍內(nèi)(如>1.0)，陰性對(duì)照OD值應(yīng)低(如<0.1)，否則需重新實(shí)驗(yàn)；
•結(jié)果判定：樣本OD值高于臨界值(Cut-off值，通常為陰性對(duì)照均值+2-3倍標(biāo)準(zhǔn)差)判定為陽(yáng)性，具體需結(jié)合試劑盒說(shuō)明書(shū)。
標(biāo)準(zhǔn)化操作流程是酶聯(lián)免疫試劑盒結(jié)果可靠性的基石，從樣本處理到OD值解讀的每一步嚴(yán)謹(jǐn)執(zhí)行，才能為科研與臨床提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支撐。
